Protocolos de clonación moleculares

by admin 09/08/2012

Protocolos de clonación moleculares

Protocolos de clonación moleculares abarcan los procedimientos utilizados para definir, aislar y reproducir una secuencia de ADN. Restricción tradicional y ligadura clonación protocolos inician fragmentación restringidas endonucleasas (enzimas que cortan las hebras de ADN en sitios de restricción), ligadura de fragmento de ADN (reparación de discontinuidades en las moléculas de ADN), transfección (la introducción de ácidos nucleicos en un cuerpo de la célula) y selección (la selección de los genomas individuales para replicación) del ADN.

Aislamiento

Protocolos para el aislamiento de ADN del fragmento, el primer paso en la clonación molecular, incorporan a menudo una reacción en cadena de polimerasa (PMR), que utiliza ciclos de calefacción y enfriamiento para amplificar pedazos de ADN. Para alcanzar el tamaño de la secuencia de meta, otros protocolos son sonicación de DNA, reacción enzima digestión y el uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente. Estos protocolos varían dependiendo de la magnitud y cantidad de ADN aislado es necesitada.

Ligadura de

Protocolos para ligadura implican utilizar una enzima, la ADN ligasa, para unir moléculas de ADN junto con un enlace covalente. Protocolo dictados combinando fragmentos de ADN, la clonación de vector, un búfer de ligadura, la ADN ligasa y agua estéril en un tubo de microcentrífuga e incubando toda la noche a 4 grados centígrados.

Transfección

Protocolos de la transfección o infusión de ADN en una célula con un medio no-viral, a menudo implican inyectar ADN directamente en el citoplasma celular. Otros métodos incluyen el uso de reactivos químicos, tales como fosfato de calcio y lípidos, para entregar el complejo a través de la membrana celular de la transfección. Este método de pruebas de los efectos de la modificación genética sobre el funcionamiento de genes específicos.

Selección

Protocolos de selección o cribado, determinan que las células realizó con éxito la inserción de ADN e indican que las células necesitan aislamiento. Una centrifugadora de cosechas las celdas que contienen la DNA transfected, que son incubados en un búfer de lisozima (una enzima natural) y tratados con un detergente alcalino, dando la solubilidad de las proteínas y las membranas. Utilizando acetato para precipitar las proteínas, una centrifugadora y estopilla filtran el sobrenadante que contiene el ADN (el líquido soluble de un compuesto centrifugado). El sobrenadante es precipitado con glicol de polietileno, se centrifugó y suspendido en cesio cloruro y etidio bromuro solución tampón. El bromuro de etidio tiñe el ADN según densidad y con una luz UV de onda larga, el ADN de la banda inferior se extrae con una jeringa de 5 cc. Una columna de intercambio iónico medio separa el ADN del etidio bromuro y cesio cloruro, y el final precipitado de ADN es suspendido en una solución tampón y detectado en electroforesis en gel de agarosa.

Related posts