Cómo aplicar el método de Lowry de la concentración celular de

by admin 10/21/2012

El método de Lowry es un ensayo bioquímico para determinar la concentración de proteína total. La prueba es un test colorimétrico que significa que los resultados se interpretan en base a la intensidad del color en la solución de ensayo. Funciona mediante la reducción de iones Cu² + a iones Cu + mediante los enlaces peptídicos de las proteínas y produce un color violeta bajo condiciones alcalinas (pH mayor que 7). Además, reactivo de Folin, que se compone de sales inorgánicas, se agrega y reacciona con residuos de los aminoácidos triptófano y tirosina produciendo un color azul verdoso. La cantidad de proteína es directamente proporcional a la intensidad del color observado de estas dos reacciones. La combinación de estas dos reacciones juntos produce una prueba muy sensible que puede dar resultados precisos hasta 0,01 mg/mL de proteína. Hay varios pasos que deben tomarse para aplicar correctamente el método de Lowry.

Instrucciones

• Coloque al menos tres diferentes conocida las cantidades de proteína en tres respectivos volúmenes medidos de agua junto con un cuarto de la muestra contiene sólo agua. El volumen debe ser el mismo en las tres diferentes soluciones que contienen cantidades conocidas de proteína y la muestra de control sin proteína. Las cantidades utilizadas varían entre los procedimientos experimentales. Estos se utilizarán como la curva estándar de comparación en el cálculo de la concentración de proteína.

• Añadir una determinada cantidad de reactivo alcalino de cobre a cada solución y mezcle bien. Este producto contiene los iones Cu2 + que oxidan los enlaces peptídicos de las proteínas produce un color violeta. La cantidad utilizada varía basado otra vez en la preferencia del volumen de solución de proteína del paso 1.

• Espere un mínimo de 10 minutos para permitir que las reacciones proceder a la terminación.

• Añadir una determinada cantidad de reactivo de Folin a cada solución, mezcle bien y permite a cada uno por 30 minutos a una hora que deje la reacción a la terminación. Otra vez, cantidades variarán en base a la experiencia específica.

• Utilice un espectrofotómetro para obtener el valor de la absorbancia para cada muestra. El fotómetro se utiliza normalmente en la gama de 500nm a 750nm para este tipo de análisis. Información de espectrofotómetro se encuentra en la sección de recursos.

• Trazar los valores de absorbancia obtenidos versus las cantidades de proteínas conocidas para las soluciones respectivas determinar la concentración de proteína.

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